提取染色体DNA和质粒DNA的方法

一、质粒构建原理

在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的**螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会*分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。

二、质粒构建试剂

1、LB培养基

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待*溶解后，用1N NaOH调pH至7.0，补加重蒸水至总体积1000ml，151bf/in2高压蒸气灭菌20分钟。

2、氨苄青霉素：100mg/ml

3、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)

4、溶液Ⅱ(临用时配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS

5、溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml

6、酚－氯仿：将酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液层，4℃保存。

7、氯仿－异戊醇：将氯仿和异戊醇按24：1的比例混合。

8、TE缓冲液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT

9、RNase 1mg/ml：称10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，此液为10mg/ml RNase浓度，应用时稀释至1mg/ml。

10、70％乙醇、无水乙醇

三、质粒构建操作

1、将含有pBS-SK质粒的大肠杆菌XL1-blue 10μl接种到10ml含氨苄青霉素(100μg /ml)的LB培养液中，37℃振摇过液。

2、取1.5ml菌液转入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，吸净上清。

3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒Eppendorf管5次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置5分钟。

5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5分钟。

6、用微量台式高速离心机12000rpm 离心5分钟，将上清转入另一Eppendorf管中。

7、加等体积酚－氯仿，剧烈振荡1分钟后，12000rpm离心5分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。

8、加等体积氯仿－异戊醇，剧烈振荡10秒钟后，短暂离心12000rpm1分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。

9、室温下加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置5分钟。

10、12000rpm离心5分钟，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暂振摇，然后再离心(12000rpm

 分钟)。

11、除去所有上清液，待待残余乙醇挥发干净后，加30μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保温15分钟，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存备用。