质粒DNA构建的酶切目的、原理、器材、试剂、实验准备

II型限制性内切酶能识别双链质粒构建DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

1．目的

学会用限制性内切酶切割质粒DNA。

2．原理

II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。

4．试剂

Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。

5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（50´储存液），细胞转染10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

6．操作步骤

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：

Pinpoint™xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl

10×酶切缓冲液（用EcoRV的缓冲液） 2 μl

ddH2O 30 μl

EcoRV 1μl

BamHI 1μl

总体积 40μl

（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。

（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在**的较适酶切温度水浴中温育1~3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段）。

（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。